Biochemie denitrifikačních bakterií

Distribuce toku elektronů v rozvětveném respiračním řetězci. Transport dusičnanu do buněk. Enzymologie flavindependentních oxidoreduktas. Odezva bakteriálního proteomu na změny růstových podmínek.

prof. RNDr. Igor Kučera, DrSc.

Vedoucí skupiny

Igor Kučera ukončil studium biochemie v roce 1979 na Univerzitě Jana Evangelisty Purkyně (nyní MU) v Brně a v témže roce obhájil doktorskou disertaci RNDr. Po změně politického systému v roce 1989 mu bylo umožněno obhájit doktorskou disertaci DrSc., a pak v roce 1992 získal habilitací místo docenta. V roce 1998 se stal řádným profesorem. Jeho výuka zahrnuje kurzy enzymologie, bioenergetiky, nerovnovážných systémů a pokročilé biochemie. Je rovněž předsedou oborové rady a garantem doktorského studijního programu Biochemie.

MUNI

O prof. Kučerovi

Kontaktní informace:

Kancelář – C05/234
Telefon – 549 49 5392
E-mail – ikucera@chemi.muni.cz

Pedagogická činnost

C8112 Enzymová biotechnologie
C8140 Bioenergetika
C8150 Bioenergetika - seminář
C5340 Nerovnovážné systémy
C8160 Enzymologie
C8170 Enzymologie - seminář

Vzdělání

1998 – profesor Biochemie, PřF MU
1992 – docent Biochemie, PřF MU
- Oxid dusnatý v denitrifikační dráze bakterie P. denitrificans
1992 – DrSc., Československá akademie věd
- Regulace denitrifikačních pochodů u bakterie P. denitrificans
1979 – RNDr., PřF UJEP (MU)
- Reakce katalysované alkoholdehydrogenasou v přítomnosti dvou substrátů a koenzymu - analytická aplikace a kinetika

Univerzitní aktivity

Člen Vědecké rady PřF MU
Garant doktorského studijního programu Biochemie
Člen Oborové rady a Oborové komise Biochemie

Oblast výzkumu

Skupina prof. Kučery se zaměřuje na výzkum biologické denitrifikace (tj. mikrobiální redukce dusičnanu na plynný dusík). Jako modelový organismus užívá běžně se vyskytující půdní bakterii Paracoccus denitrificans. Hlavním cílem je objasnit, jak probíhá regulace elektronového toku z růstových substrátů ke konečným elektronovým akceptorům respirace, kyslíku a oxosloučeninám dusíku, a k energetickému zásobnímu polymeru polyhydroxybutyrátu. Pro zjišťování funkce jednotlivých genů slouží metody jejich vyřazení („knockout“) či jejich zvýšené exprese, společně s biochemickými analýzami na úrovni celých buněk. Nedávno bylo například zjištěno, že mutační inaktivace některých enzymů respiračního řetězce potlačuje inhibiční efekt kyslíku na redukci dusičnanu. Bakteriální kmeny denitrifikující za aerobních podmínek by mohly nalézt uplatnění při bioremediaci vod kontaminovaných dusičnany, a pro snížení tvorby oxidu dusného, který je skleníkovým plynem.

Skupina se rovněž zabývá výzkumem skupiny flavin mononukleotid-dependentních enzymů, spojených s odpovědí na respirační stres u P. denitrificans. Struktury těchto proteinů byly zjištěny pomocí rentgenové krystalografie a deponovány ve veřejně přístupné databázi Protein Data Bank (PDB ID: 3U7R, 4XHY, 4XJ2, 7PLE, 7QW4). Navzdory vzájemné strukturní podobnosti se tyto enzymy liší svou substrátovou specifitou: vykazují rozdílné reduktasové aktivity vůči strukturně rozmanitým substrátům jako jsou benzochinonové deriváty, superoxid, kyslík, a sloučeniny s organicky vázaným arsenem. V současnosti je vyvíjena snaha o vysvětlení příčin těchto odlišností na základě rozdílů v uspořádání aktivního místa a zúčastněných aminokyselinových zbytků. Probíhá také identifikace a studium transkripčních faktorů zodpovědných za míru exprese těchto enzymů.

Nedávné publikace

Sedláček V, Kučera I. Arginine-95 is important for recruiting superoxide to the active site of the FerB flavoenzyme of Paracoccus denitrificans. FEBS Lett. 2019; 593(7): 697-702. doi: 10.1002/1873-3468.13359.

Bakteriální flavoproteiny rodiny FerB mají pozitivně nabitý argininový zbytek blízko vázaného kofaktoru FMN. Dříve byl považován za vazebné místo pro oxoanionty chromu nebo uranu, anorganických substrátů podléhajících enzymově katalyzované redukci. Publikace ukazuje, že skutečným fyziologickým substrátem může být superoxid, cytotoxický produkt jednoelektronové redukce kyslíku. Superoxidreduktasová aktivita enzymu má zřejmě úlohu při ochraně buněk před oxidačním stresem.

***

Sedláček V, Kučera I. Functional and mechanistic characterization of an atypical flavin reductase encoded by the pden_5119 gene in Paracoccus denitrificans. Mol. Microbiol. 2019; 112(1):166-183. doi: 10.1111/mmi.14260.

Flavoproteinové oxidasy katalyzují oxidaci substrátů kyslíkem, který je redukován na peroxid vodíku. Tyto enzymy zpravidla obsahují pevně vázáný flavinový kofaktor. Publikace charakterizuje enzym, který váže flavin pouze volně a formálně vzato katalyzuje třísubstrátovou reakci FMN (flavin) + NADH (fyziologický elektronový donor) + O₂ (elektronový akceptor). Popisovaný enzym může představovat vývojový mezistupeň mezi flavinreduktasami a flavoproteinovými oxidasami.

***

Sedláček V, Kučera I. Modifications of the Aerobic Respiratory Chain of Paracoccus Denitrificans in Response to Superoxide Oxidative Stress. Microorganisms. 2019; 7(12):640. doi: 10.3390/microorganisms7120640.

Aerobní respirace probíhá na buněčné úrovni jako sled redoxních reakcí, které v respiračním řetězci přenášejí elektrony od substrátu na kyslík. Nežádoucím vedlejším jevem je tvorba superoxidu a dalších reaktivních forem kyslíku (reactive oxygen species, ROS). Publikace ukazuje, že ROS poškozují samotný respirační řetězec přímou inaktivací vstupních dehydrogenas. Dalším mechanismem, platným pro oxidasu typu cytochromu cbb₃, je inaktivace pozitivně působícího transkripčního faktoru FnrP.

***

Kučera I, Sedláček V. Involvement of the cbb₃-Type Terminal Oxidase in Growth Competition of Bacteria, Biofilm Formation, and in Switching between Denitrification and Aerobic Respiration. Microorganisms. 2020; 8(8):1230. doi: 10.3390/microorganisms8081230.

Respirační řetězec studované bakterie obsahuje tři různé terminální oxidasy schopné redukovat kyslík. Jejich fyziologická role zatím nebyla objasněna. Publikace popisuje, že terminální oxidasa typu cytochromu cbb₃ značně zvyšuje kompetiční úspěch bakterie při růstu ve smíšených kulturách limitovaných kyslíkem a rovněž i schopnost bakterie vytvářet biofilm. Mutační inaktivace enzymu způsobuje, že původně anaerobní redukce dusičnanu na dusík (denitrifikace) může probíhat také v přítomnosti kyslíku.

***

Sedláček V, Kryl M, Kučera I. The ArsH Protein Product of the Paracoccus denitrificans ars Operon Has an Activity of Organoarsenic Reductase and Is Regulated by a Redox-Responsive Repressor. Antioxidants. 2022; 11(5):902. doi: 10.3390/antiox11050902.

Resistence buňky vůči sloučeninám arsenu je zprostředkována operonem ars. Jedním z kódovaných proteinů je ArsH, dříve považovaný za organoAs(III) oxidasu. V rozporu s tímto názorem se ukázalo, že ArsH u P. denitrificans je schopen katalyzovat pouze obrácenou reakci – redukcí organoAs(V). Získané výsledky naznačují, že ArsH má obecnější ochrannou úlohu při různých formách oxidačního stresu a nikoli pouze při detoxifikaci arsenu.

***

Kryl M, Sedláček V, Kučera I. Structural Insight into Catalysis by the Flavin-Dependent NADH Oxidase (Pden_5119) of Paracoccus denitrificans. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24(4):3732. doi: 10.3390/ijms24043732.

Publikace přináší nové strukturní informace o flavin-dependentní NADH oxidase popsané dříve (Sedláček & Kučera, Mol. Microbiool. 2019, 112, 166-183). Kombinací enzymologických přístupů (stacionární a prestacionární enzymová kinetika, analýza závislostí kinetických parametrů na pH, inhibice modifikačními činidly specifickými pro jednotlivé typy aminokyselinových zbytků) se stanovením krystalové struktury a místně řízenou mutagenezí se podařilo identifikovat tři aminokyselinové zbytky klíčové pro katalýzu. His-117 váže vodíkovou vazbou atom N3 isoalloxazinového kruhu FMN a fixuje tím kruh do pozice optimální pro redoxní reakci s NADH. Interakce aminoskupiny Lys-82 s karboxamidovou skupinou NADH zabrání volné rotaci nikotinamidového kruhu kolem vazby N1-C1´ a způsobí, že přenos hydridu z NADH na FMN probíhá stereospecificky z polohy pro-S. Arg-116 svým kladným nábojem podporuje přenos elektronu z redukovaného FMN na dikyslík.

Členové skupiny

Mgr. Vojtěch Sedláček Ph.D. – lektor II

Doktorandi: Ivo Fukala, Martin Kryl
Absolventi doktorského studia: Pavel Bouchal, Martin Hubálek, Marek Koutný, Michal Kuňák, Jiří Mazoch, Nikola Ptáčková, Vladimír Rotrekl, Vojtěch Sedláček, Jiří Zouhar

Mezinárodní spolupráce

IKBM, Norwegian University of Life Sciences (NMBU) – prof. Åsa Helena Frostegård
Systems Biology Lab, Vrije Universiteit Amsterdam, Nizozemsko – dr. Rob van Spanning